Lunds universitet firar 350 år. Läs mer på lu.se

Meny

Javascript verkar inte påslaget? - Vissa delar av Lunds universitets webbplats fungerar inte optimalt utan javascript, kontrollera din webbläsares inställningar.
Du är här

Fakta om konfokal lasersvepmikroskopi

Hur fungerar det?

I konfokal lasersvepmikroskopi fokuseras en laserstråle till en diffraktionsbegränsad punkt i fokalplanet. Bilder av mikroskoppreparatet skapas genom att svepa laserstrålen över fokalplanet, och mäta variationerna i fluorescensens (eller det reflekterade ljusets) intensitet.

En aperturbländare ("pinhole") framför fluorescensdetektorerna, placerad så den sammanfaller med objektivets fokalplan (därav konfokal), utesluter det mesta av ljuset som inte kommer från fokalplanet. Genom att mäta fluorescens som huvudsakligen kommer från fokalplanet, erhåller man bild som är ett "optiskt snitt" av preparatet.

Strålgången i ett konfokalmikroskop
Schematisk skiss över strålgången i ett konfokalmikroskop. Illustration:Peter Ekström

Om man skapar en serie optiska snitt från olika fokalplan i preparatet kan dessa läggas samman i en "z-stack" som kan användas för 3D-analys och 3D-rendering av de fluorescerande strukturerna.

Illustration av optiska snitt
Schematisk skiss över optiska snitt. Illustration:Peter Ekström

Vad är så bra med konfokalmikroskopi?

Den omedelbara vinsten med konfokalmikroskopi i jämförelse med vanlig epifluorescensmikroskopi är den oerhört mycket bättre upplösningen i djupled. Med ett högupplösande objektiv (numerisk apertur 1,3 - 1,4) skapar man bilder där huvuddelen av signalen kommer från ca. 0,5 µm tjocka optiska snitt! Med ett vanligt epifluorescensmikroskop (med samma objektiv) skapar man en bild som innehåller ljus från hela preparatets tjocklek. Konfokalmikroskopi förbättrar alltså signal/brus-förhållandet i fokalplanet oerhört mycket, vilket gör att små strukturer är lättare att urskilja.

Observera dock att upplösningen – dvs förmågan att särskilja små strukturer – i bildplanet (x/y) endast är ca. 25% bättre än i vanlig ljusmikroskopi. Förbättringen beror på att koherent laserljus kan fokuseras till en skarpare punkt än icke-koherent ljus från t.ex. en Hg-lampa – i övrigt är det "samma mikroskopoptik". Men, tillsammans med förbättringen i signal/brusförhållande pga den optiska snittningen ger denna förbättring överlägsen detektion av t.ex. co-lokalisation av fluorescerande markörer.

Och vilka är begränsningarna?

Man kan naturligtvis inte skapa högupplösta bilder av djupt liggande strukturer i hur tjocka preparat som helst. En fysisk begränsning är objektivets arbetsavstånd, dvs avståndet mellan objektivets yta och fokalpunkten. I verkligheten är det dock oftare faktorer som preparatets optiska täthet och variationer i brytningsindex som sätter en absolut gräns vid ett maxdjup av 200 µm i biologiska preparat. Om man har behov av att studera djupare volymer bör man överväga att använda multifotonmikroskopi som kan fungera till ca. 500 µm djup.

Konfokal lasersvepmikroskopi är ett utmärkt verktyg för många typer av studier av dynamiska förlopp. Laserstrålens svephastighet begränsar dock hur snabba förlopp som kan studeras. För studier av många biologiska förlopp på cellnivå (och vissa biokemiska!) kan man "zooma in" och endast scanna en liten yta/volym, och därigenom uppnå en adekvat bildfrekvens. Om inte detta räcker, bör man överväga att använda konventionell epifluorescens, TIRF, eller spinning disk confocal microscopy, där tidsuppupplösningen begränsas av CCD-kamerans read-out hastighet.

Slutligen, som nämnts ovan, är upplösningen (x/y) i ett konfokalmikroskop endast marginellt bättre än i vanlig ljusmikroskopi. Om man behöver kunna urskilja och exakt lokalisera ännu mindre strukturer med hjälp av fluorescerande markörer, måste man använda sig av någon av en mångfald s.k. super-resolution (el. subdiffraktion) mikroskopimetoder, som STED, GSD, GSDIM, PALM, STORM etc. Observera att dessa metoder är mycket specialiserade, har mycket stora begränsningar, och kräver speciell (ofta icke kommersiellt tillgänglig) tekniskt avancerad utrustning! Ett annat alternativ är att använda quantum dots som först kan visualiseras med fluorescens, och därefter exakt lokaliseras med elektronmikroskopi!

Sidansvarig:

Kontakt

Ola Gustafsson

Ola Gustafsson
Forskningsingenjör
Funktionell zoologi

Telefon: 046-222 93 43
E-post: Ola [dot] Gustafsson [at] biol [dot] lu [dot] se

Fördjupad support

Biologiska institutionen rekommenderar att du kontaktar ImaGene-iT för mer ingående support avseende experimentdesign och praktisk optimering för konfokalmikroskopi.

Bo Holmqvist
070-984 93 38
bo [at] imagene-it [dot] se

Acknowledgement

Om du publicerar resultat som du fått fram vid användandet av biologiska institutionens mikroskop uppskattar vi om du nämner oss i acknowledgements. Tex "We acknowledge the Microscopy Facility at the Department of Biology, Lund University".

Vi är också tacksamma om vi efter att ni publicerat artikeln skulle kunna få en pdf-version av denna. Efter ert godkännande lägger vi då gärna upp en länk till er artikel från denna sida.